Лейкоциты в камере горяева. Ход работы

Принцип основан на определении форменных элементов, выделенных с мочой за одну минуту.

Ход исследования:

1. Мочу собирают 3 часа

2. Измеряют количество.

3. Перемешивают, берут 10 мл.

4. Центри­фугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин.

5. Надосадочную жидкость отсасывают, оставляя 1 мл.

6. После пере­мешивания заполняют камеру Горячева.

7. Считают фор­менные элементы над всей сеткой.

8. Количество форменных элементов выделенных с мочей за одну минуту вычисляют по формуле.

В норме за 1 мин с мочой выделяется до 2 000 лейко­цитов и 1000 эритроцитов.

Устройство и правила работы с камерой Горяева.

Камера Горяева представляет толстое, прямоугольное, прозрачное стекло, прорезанное четырьмя поперечными бороздами. Борозды делят стекло на пластинки – 2 боковые и одну среднюю. Средняя пластинка пересечена поперечной канавкой на две равные части. Средняя пластинка на 0,1 мм ниже боковых. На каждой половинке средней пластинки нанесена сетка Горяева. Перед работой притирается покровное шлифованное стекло. Оно должно прикрывать обе боковые и среднюю пластинки. Появление радужных колец Ньютона, свидетельствует о том, что стекло притерто правильно. Между средней пластинкой и покровным стеклом имеется щель. Это и есть камера, в которую заливают биопробу.

Глубина камеры 0,1 мм. Сетка Горяева квадратная. Сторона сетки 3мм, площадь 9мм 2 . Сетка разделена на 225 больших квадратов (15 по горизонтали, 15 по вертикали). Часть больших квадратов (через два на третий) разделено на 16 малых. Сторона малого квадрата 1/20 мм. Площадь малого квадрата 1/20 х 1/20 = 1/400 мм 2 . Высота камеры 1/10 мм. Объем крови над малым квадратом 1/400 х 1/10 = 1/4000 мкл (или мл).

Подсчет в камере производят под малым увеличением (объектив 8, окуляр 10 или 15, конденсор опущен, диафрагма прикрыта). Камеру устанавливают на предметный столик микроскопа. Под малым увеличением находят изображение камеры. Устанавливают в поле зрения верхний левый угол сетки камеры.

Подготовка камеры Горяева к работе. Камеру и шлифовальное стекло моют под проточной водой, насухо вытирают. На участок камеры с нанесенными сетками укладывают шлифованное покровное стекло, осторожно нажимая большими пальцами на края покровного стекла, его притирают к боковым пластинкам камеры до появления радужных колец Ньютона. С помощью стеклянной палочки каплю исследуемой жидкости помещают перед щелью, образующейся между покровным стеклом и счетной камерой. В силу закона капиллярности жидкость заполняет пространство подпокровным стеклом над сеткой. При заполнении камеры надо стараться, чтобы исследуемая жидкость не растекалась в борозды камеры и, чтобы в камеру не попали пузырьки воздуха. Все это может изменить правильное распределение элементов крови в камере. Равномерность заполнения и распределения форменных элементов и цилиндров по сетке камеры проверяют под микроскопом. После заполнения камеру оставляют стоять на 1-2 мин., чтобы элементы осели на дно и движение их прекратилось.

Для определения гематокрита произведите забор крови из пальца (работа № 1) в специальный капилляр для определения гематокрита. Капилляр обязательно обработайте антикоагулянтом - гепарином или раствором цитрата натрия. Капилляр заполните кровью на 7 / 8 его длины (при заполнении капилляра в него не должны попадать пузырьки воздуха), закупорьте специальной замазкой с того конца, через который брали кровь. Поместите капилляры с кровью в ротор центрифуги таким образом, чтобы закупоренные концы были направлены кнаружи от оси вращения и упирались в резиновую прокладку, центрифугируйте в течение 5 мин. Определите гематокрит по специальной шкале или с помощью линейки. В последнем случае измерьте высоту столбика эритроцитов (В э) и высоту столбика плазмы (В п). Рассчитайте гематокрит (как процент форменных элементов от всего объема крови) по формуле:

Рекомендации по оформлению протокола работы. Полученные результаты определения гематокрита занесите в протокол опытов, оцените их, исходя из того, что показатели нормы гематокрита для здорового человека: 43% для женщин, 45% - для мужчин. Такое состояние носит название нормоцитемии . Если относительный объем форменных элементов составляет менее 43%, то это носит название олигоцитемии , а если более 45%, то полицитемии .

Увеличение гематокрита наблюдается при эритроцитозе, уменьшение - при эритропении или микроцитозе (уменьшение размера эритроцитов) на фоне неизменной концентрации эритроцитов. Теоретически гематокрит должен увеличиваться при макроцитозе (увеличение размера эритроцитов), но последний наблюдается только на фоне выраженной эритропении.

Новорожденные имеют высокий гематокрит, составляющий всреднем 57 %. Дальнейшая динамика этого показателя соответствует изменениям количества эритроцитов в периферической крови.

Знакомство с устройством камеры Горяева

Камера Горяева представляет собой специальное устройство для подсчета форменных элементов крови. На ее поверхности нанесена сетка, разделяющая пространство на квадраты: большие и маленькие.

Камера Горяева представляет собой толстое прямоугольное стекло с двумя сетками, выгравированными на его поверхности (рис. 12). Сетки отделены одна от другой поперечной канавкой во избежание затекания жидкости. Двумя глубокими продольными

Рис. 12. Камера Горяева

А – вид сверху (а – маленький квадрат,

б – большой квадрат);

В – вид сбоку; В – сетка

канавками сетки отделены от стеклянных прямоугольных пластинок, к которым притирают шлифованное покровное стекло. Плоскость поверхности этих пластинок находится на 0,1 мм выше плоскости, в которой нанесены сетки. Камера состоит из 225 больших квадратов. Сто квадратов не разлинованы; 25 больших квадратов разделены каждый на 16 малых объемом 1/4000 мкл. Во избежание двукратного подсчета клеток, находящихся на линиях сетки, пользуются правилом буквы «Г»: считаются клетки, относящиеся к данному квадрату и лежащие внутри квадрата и на левой и верхней границе; клетки, пересекающие правую и нижнюю границу, не подсчитываются.

Устройство камеры и сетки Горяева . Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, прорезанное четырьмя поперечными бороздами. Борозды делят стекло на пластинки - две боковые и среднюю. Средняя пластинка на 0,1 мм ниже боковых. Она разделена поперечной бороздкой на 2 равные части. На каждой половине средней пластинки нанесена сетка Горяева. Принадлежностью" камеры служит шлифованное покровное стекло. Его следует наложить так, чтобы оно покрыло обе боковые и среднюю пластинки. Нажимая большими пальцами на края стекла, его притирают к боковым пластинкам до появления радужных колец (кольца Ньютона).

Так как боковые пластинки выше средней, между нею и покровным стеклом остается щель. Это и есть камера, в которую заливают разведенную кровь. Глубина камеры 0,1 мм.

Нанесенная на дно камеры сетка Горяева квадратная. Сторона ее - 3 мм, площадь--9 мм » . Сетка разграфлена на 225 больших квадратов-15 по горизонтали и 15 по вертикали. Часть больших квадратов (через два на третий) разделена на 16 малых квадратов. Сторона малого квадра­та равна 1/20 мм.

Техника подсчета . Правильное заполнение счетной камеры разведенной кровью обеспечивает точность под­счета форменных элементов. Перед заполнением камеры содержимое пробирки перемешивают, вращая ее между ладонями в течение 2 мин. Разведенную кровь наносят на среднюю пластинку камеры пастеровской пипеткой с баллоном или стеклянной палочкой, помещая ее около края покровного стекла. По закону капиллярности жид­кость затекает под стекло, заполняя камеру.

После заполнения камеру нужно положить на стол на 2-3 мин, пока движение жидкости в ней не прекратится, и клетки не расположатся неподвижно на фоне квадратов сетки. При заполнении камеры жидкость не должна стекать в борозды. Недопустимо попадание в камеру пузырьков воздуха.

Подсчет производят под малым" увеличением микро­скопа (об.8, ок.10 или 15), конденсор должен быть опущен, а диафрагма закрыта.

Возможные ошибки при подсчете:

Правила :

К данному квадрату принадле­жат клетки, находящиеся большей своей половиной внут­ри него;

Клетки, разделенные пограничной линией попо­лам, считают только на верхней и левой границе квадрата;

Клетки же, лежащие большей своей половиной вне данно­го квадрата не считают вовсе.

Принцип . Подсчет эритроци­тов под микроскопом в определенном количе­стве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведе­ния крови.

Реактивы . 0,9 % раствор хлорида натрия

Специальное оборудование . 1. Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп.

Ход исследования . Разводят иссле­дуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую про­бирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипет­кой набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вы­тирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки; пипетку тща­тельно промывают в верхнем слое жидкости, повторно набирая ее и выдувая в пробирку, содержимое пробирки перемешивают и остав­ляют стоять до момента счета (рекомендуется считать эритроциты в ближайшие 2-3 ч после взятия крови, а при гемолитических и. В 12-дефи­цитных анемиях - сразу после взятия, так как эритроциты могут разрушиться). Недопустимо оставлять взятую кровь с несосчитанными эри­троцитами на следующий день, так как эритро­циты частично разрушаются.

Подготавливают счетную камеру : протирают насухо камеру с сеткой и покровное стекло, за­тем покровное стекло притирают к камере, слегка надавливая на стекло таким образом, чтобы по краям его появились радужные полосы (это сви­детельствует о требуемой высоте камеры - 0,1 мм).

Заполняют счетную камеру разведенной кровью : предварительно несколько раз тщатель­но встряхивают содержимое пробирки, затем пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха запол­нила всю поверхность камеры с сеткой, не зате­кая в бороздки. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении 1 мин (ДЛЯ ОСЕДАНИЯ эритроцитов).

Для подсчета эритроцитов - микроскоп (объектив на 8х, окуляр на 10Х), находят верхний левый край сетки. Счет производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т. е. в 80 малых квадратах.

Расчет количества эритроцитов:

производится по следующей формуле:

Х= а ■ 4000 ■ в

где X - количество форменных элементов в 1 мкл крови;

а - количество формен­ных элементов, сосчитанных в 80 малых квадратов;

б- количество сосчитанных малых квадратов;

в - степень разведения крови; 1\4000 мкл - объем малого квадрата; умножая на 4000, приводим к объему 1 мкл крови.

Сокращенная формула: Х= а х10000

Нормативные показатели:

У мужчин: 4,0-5,0 х 10 12

У женщин: 3,7-4,7 х 10 12

Клинико-диагностическое значение: Снижение числа эритроцитов в крови является одним из ос­новных лабораторных критериев анемии. Однако степень эритроцитопении широко варьирует при разных формах малокровия. Так, при наиболее распространенном заболевании - железодефицитной анемии на почве хронических кровопотерь - количество эритроцитов может быть нор­мальным или нерезко сниженным (3 10 6 - 3,6-10 6 в 1 мкл, или 3-10" 2 /л - 3,6-10 |2 /л). При острой кровопотере, В|2 -дефицитной анемии (в стадии рецидива), гипопластической анемии, гемолитических анемиях (в период криза) число эритроцитов в крови может значительно сни­зиться и достигнуть I -10 6 в 1 мкл, или 1 10 |2 /л и менее.

Повышение количества эритроцитов в кро­ви - эритроцитоз - может быть обусловлен многими причинами. Значительный эритроцитоз (6,5-10 6 -8,5-10 е в 1 мкл, или 6,5-10 |2 /л - 8,5-10 |2 /л крови) является одним из важных лабораторных симптомов эритремии. Другие гемобластозы миелопролиферативной природы (сублейкемический миелоз или миелофиброз и хронический миелолейкоз) реже сопровождают­ся эритроцитозом и только в начальной стадии заболевания.

Вторичный (симптоматический) эритроцитоз может сопутствовать широкому кругу различ­ных заболеваний и бывает абсолютным (связан­ный с усилением нормального эритропоэза) и от­носительным (гемоконцентрационный). Абсо­лютные эритроцитозы сопутствуют хроническим обструктивным заболеваниям легких, врожден­ным порокам сердца, первичной легочной гипертензии, синдрому Пиквика, наследственным гемоглобинопатиям, гипернефроидному раку, гемангиобластоме мозжечка, гепатоме, гормо­нально-активным опухолям, заболеваниям, со­провождающимся стенозом почечных артерий, заболеваниям ЦНС и др. Вторичные относитель­ные эритроцитозы связаны с нарушением гемо-концентрации и характеризуются нормальным объемом циркулирующих эритроцитов при сни­жении массы циркулирующей крови и массы циркулирующей плазме.

Патологические формы эритроцитов

Повышение числа эритроцитов - полицитемия, мо­жет быть истинной (опухолево-пролиферативный процесс) и симптоматической (реактивное раздражение эритропоэза, сгущение крови, нарушение нервной регуляции и пе­рераспределения). Понижение числа эритроцитов - ане­мия (постгеморрагическая, гемолитическая, вследствие нарушения кроветворения).

Качественные изменения эритроцитов . Анизоцитоз - изменение величины эритроцитов (эритроциты меньших размеров называются микроцитами; больших - макроцитами, эритроциты диаметром 12 мкм и более называются мегалоцитами). Пойкилоцитоз - изменение формы эритроцитов (грушевидные, серповидные - дрепаноциты, каплевидные, мишеневидные, с вытянутыми концами, шизоциты - обломки разрушенных эритроци­тов, акантоциты - эритроциты зубчатой формы, стоматоциты - эритроциты с просветлением в центре в виде узкой линейной полоски как форма рта, эхиноциты - эритроциты с множественными выростами, анулоциты - эритроциты в виде пустых колец). Анизохромия - из­менение интенсивности окраски эритроцитов в патологи­ческих случаях. Встречаются бледно окрашенные эрит­роциты - гипохромия, интенсивно окрашенные - гиперхромия. Эритроциты могут окрашиваться не только кислыми, но и основными красителями - полихромазия.

Обнаруживаются при патологии в периферической кро­ви ядросодержащие эритроциты: нормобласты, эритро­бласты и мегалобласты. Мегалоциты и мегалобласты ха­рактерны для анемии Аддисона-Бирмера.

В эритроцитах можно иногда обнаружить остатки ядерной оболочки - так называемые кольца Кебота и ядерные остат­ки - тельца Жолли при мегалобластных анемиях, отравле­нии гемолитическими ядами и др. При свинцовом отравлении и у людей, принимающих препа­раты крови, наблюдается базофильная пунктуация эритроци­тов (наличие точечной зернисто­сти). Сидероциты - эритроциты с включениями не гемоглобинового железа (ферритин, гемосидерин) в виде мелких гранул синего цвета.

2.5 Подсчет лейкоцитов